بخش دوم
بخش دوم
الف- تهيه لام يا اسلايد آنتي ژن شيزونت
آنتي ژن مورد استفاده براي schizont IFA test ازتيره سلولي شيزونت ليمفوبلاستوئيد Lymphoblastoid گرفته ميشود. كشتهاي سلولي را كه داراي رقت 200 ميلي ليتر شيزونت در يك ليتر شيزونت هاي آلوده ( به T. parva ويا T. annulata بوده و حاوي ده ميليون سلول در هر ميلي ليتر و حداقل 90% سلولها آلوده ميباشند ) باشد را سانتريفيوژ كرده ( بمدت 20 دقيقه در سرعت 200 دور در دقيقه در دماي 4 درجه ) و مايع روئي را دور ريخته و سلولهاي ته نشين شده را با 100 ميلي ليتر بافر ( Phosphate buffered saline) PBS در دماي 4 درجه و pH 7.2 تا 7.4 مخلوط و دوباره سانتريفيوژ ميكنيم. اين روش شستشو را سه بار تكرار كرده و در آخرين با رسلولهاي ته نشين شده را با 100 ميلي ليتر PBS مخلوط كرده تا غلظت نهائي حدودCELL/ML7 10 درآيد.
گسترش نازك از محلول سلولي را روي اسلايد حفره دار ( از جنس تفلن )تهيه كرده ويا روي لام معمولي را با استفاده از لاك ناخن تقسيم كنيم . هر گسترش بايد داراي 50 تا 80 سلول سالم در هر ديد ميكروسكوپي Field باشد (وقتيكه با بزرگنمايي 40 با روغن Immersionبررسي شود) .بوسيله پي پت 100μlآنتي ژنهارا با مكش يكدفعه روي لام ريخته كه پس از توزيع محلول شيزنت يا پيروپلاسم يك لايه Monolayer در هر كدام باقي مي ماند. اينكار را براي هر حفره انجام داده تا مايع تمام شود. بااين روش تقريبا“مي توان 600لام با كيفيت خوب كه حاوي 6 هزار سلول در هر نقطه آنتي ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشك كرده ودراستن بمدت ده دقيقه ثابت كرده (Fixation) وبطور جداگانه دردستمال كاغذي پيچيده و سپس در كاغذ آلومينيم (فويل آلومينيم ) وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردماي20- درجه سانتيگراديا 70 - درجه سانتيگراد نگه مي داريم . دردماي –20 درجه سانتيگراد بمدت يكسال قابل استفاده هستند ودردرماي –70 درجه سانتيگراد بمدت طولاني تر (دردماي يخچال 4 درجه سانتيگراد بمدت چهارماه قابل نگهداري هستند).
ب- محلول آنتي ژن شيزونت
ابتدا 500 ميلي ليتر از محلول T.annalataيا T. parva سلولهاي آلوده با غلظت 10 6cell/ml سلول سانترفيوژكرده (در 150 g دور دردقيقه براي ده دقيقه در دماي 4 درجه ) وسلولهاي ته نشين شده در100سي سيPBS سرد دوبار شستشو مي دهيم.
قابليت زنده بودن سلولها را بوسيله اوزين Eosin يا Trypan blueبررسي ميشود (كه بايد بيش از %90باشد )محلول سلولها بايد درمحلول سرم فيريولوژي سرد رقيق شود تا غلظت 7 10سلول (/mlCell) بدست آيد دراين حجم ، دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوي 80% استن و 0.1 % فرمالين در PBS قطره قطره اضافه كرده (در درماي –20 درجه )تا درمدت 24 ساعت به تثبيت رسد.
سلولهاي ثابت شده را سه بار شستشو داده (در سرم فيولوژي سرد شده دردماي 4 درجه ) ودر 200 دور دردقيقه بمدت 20 دقيقه سانترفيوژ ميكنيم. بعد از آخرين شتشو سلولهاي ته نشين شده را در سرم فيولوژي رقيق كرده تا غلظت 107/ml بدست آيد . بميزان 5/0 سي سي سلولهاي ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسيم مي كنيم .
تهيه اسلايد حاوي آنتي ژن پيروپلاسم:
مرحله پيرپلاسمي گونه هاي تيلريا را نمي توان دركشت سلول نگهداري يا تهيه نمايند. زيرا آنتي ژن پيروپلاسمي بايد از حيوانات زنده آلوده تهيه شود و عفونتهاي تجربي بوسيله تزريق زير پوستي با اسپروزئيت يا كنه هاي آلوده باT.parvaT.taurotragi ,T.annulata , صورت ميگيرد. آلودگي گروه انگلي T.sergenti/ T.buffeli/ T.orientalis ,T.mutans or T.velifera بوسيله تزريق داخل رگي خون حيوان ناقل به گاو يا گوساله طحال برداشته و يا تماس با كنه آلوده ايجاد مي شود. وقتيكه آلودگي پيروپلاسمي بيش از 5%باشد، صد ميلي ليتر خون آلوده آغشته با مواد ضد انعقاد را بخوبي با PBS مخلوط مي كنيم . اين مخلوط را سانترفيوژ كرده (با500دور در دقيقه براي ده دقيقه) و بعدپلاسما و Buffy Coat را جدا كرده و RBCهاي باقي مانده را بادوليتر PBSرقيق مي كنيم. سپس دوباره سانترفيوژ كرده وهمينطور Buffy coat را جدا ميكنيم . اين عمل رابراي چهار بار تكرار مي كنيم و بعد از پنجمين ششتشو، مقداري از RBC هاي جمع شده Packed RBC را با PBS مخلوط كرده واز آن 5μl روي هر اسلايد مي گذاريم. نقاط خشك شده را با متانول تثبيت كرده وبا رنگ آميزي گيمسا رنگ ميكنيم ونهايتا زيرميكروسكوپ نوري بررسي مي كنيم . تقريبا ده هزار اسلايد آنتي ژني (صد هزار نقاط آنتي ژن ) ا ز100سي سي خون آلوده تهيه مي شود. اسميرهاي آنتي ژني را در دماي اتاق خشك كرده وبعد در دماي 4 سانتيگراد درجه در استن بمدت ده دقيقه فيكس ميكنيم. اسميرهاي فيكس شده شبيه اسلايدهاي آنتي ژني شيزونت نگهداري ميشوند.
محلول يا سوسپانسيون حاوي پيروپلاسم :
يك روش تهيه آنتي ژن براي T.parva قبلا“شرح داده شد دراين روش صد ميلي ليتر از خون حيوانيكه شديدا“ در مرحله آلودگي پيروپلاسمي باشد گرفته و مانند آنچه شرح داده شد،گلبولهاي قرمز تجمع كرده را به PBS اضافه كرده تا محلول 5% بدست آيد.- در مراحل فوق بايد آنتي ژن را استانداردكرد-
تهيه lysateBovine Lymphocyte : اين ماده طبق روش Godderis et al.براي بررسي محلول آنتي ژن T. parva بكار مي رود . ابتدا يك گوساله سه ماهه كه طحال آنرا برداشته اند را درنظر گرفته و واز طريق تماس با كنه و يا پشه تسه تسهtse Tseآلوده مي كنيم وروزانه بمدت چهارهفته با رنگ آميزي گيمسا بررسي ميكنيم . نهايتا بعد از مرگ يا كشتن حيوان از تيموس و غددلنفاوي نمونه برداري مي كنيم .
بافتها را به قطعات كوچكتر تقسيم كرده ودر PBS سرد ( در دماي 4 درجه) بهمراه %45 /.0 مواد ضد انعقاد نگهداري ميكنيم . سلولها را از بافت بوسيله پارچه MUSLIN جدا كرده و سه بارشتشو با مخلوط PBS-EDTAميدهيم و در دور 200 بمدت 20 دقيقه در دماي 4 درجه سانتريفيوژ ميكنيم . لينفوسيتهاي شسته شده را با PBS كه عاري از EDTA باشد، مخلوط مي كنيم تا غلظت نهائي CELL/ML 107*5 بدست آيد .
روش كار براي تشخيص آنتي بادي فلورسانس:
اسلايد شيزونت يا پيروپلاسم را از دماي انجماد، 20- درجه سانتيگراد در آورده و بمدت 30 دقيقه در دماي يخچال، 4 درجه گذاشته و سپس 30 دقيقه ديگر در دماي اتاق ميگذاريم.
بوسيله پي پت پاستور 100/μl آنتي ژن را روي هر لام ريخته ودردماي اتاق 37 درجه خشك مي كنيم . ميتوان براي تلعلع بهتر وديد بهتر از Evansblue نيزبهمراه رنگ فلورسانس استفاده كرد و بعد در گلسيرول 50% در pH 8 ميگذاريم تا رنگ Fluorescein isothiocyanate بمدت طولاني تر و عميق تر اثر گذارد . اسلايدهاي تهيه شده تا 72 ساعت در دماي 4 درجه د رتاريكي قابل نگهداري و استفاده ميباشند. بدنبال عفونت با اسپروزئيت ها آنتي بادي هاي توليد شده بر عليه T.parva و T.annulate ابتدا" بين روزهاي دهم تا 14 برعليه شيزونت ودر بين روزهاي 15-21 بر عليه پيروپلاسم قابل تشخيص مي باشند. پادتنها بعد از بهبودي ناپديد مي شوند ووابسته به فاكتورهاي متفاوتي از جمله وضعيت ناقل، فاصله مابين درمان، درمعرض قرار گرفتن و تماس دوباره با كنه آلوده تغيير مي كنند. معمولا“ 4 تا 6 ماه بعد از آلودگي آنتي بادي پائين مي آيد (در صورتيكه تماس دوباره پيش نيايد).
بدنبال آلودگي با T.mutans آنتي بادي در روزهاي دهم تا 15 قابل اندازه گيري بوده و بعد از 12-24 ماه پائين ميآيد.
ب: نيازمنديهاي لازم جهت تهيه واكسنها و تشخيصهاي بيولوژيك
1- واكسنهاي كشت سلولي براي تيلريا آنولاتا:
از اوائل قرن بيستم كه عامل بيماري تيلريا شناخته شد مايهكوبي برعليه بيماري تيلريا مورد نظر قرار گرفت . گرچه يك واكسن زنده با قدرت ايمني زائي شناخته شده اخيرا“به توليد رسيده است چيزي كه بيشتر تا حالا مورد استفاده قرار گرفته كشت سلولي شيزونت تغيرحدت يافته است . براي مقابله با تيلريا آنولاتا نحوه توليد و تستهاي ارزشيابي قبلا“ تشريع شده است . اين نوع واكسن بصورت گستردهاي در كشورهاي ايران ،تركيه ،هندوستان وروسيه و چين مورد استفاده قرار گرفته است.
بخش دوم
الف- تهيه لام يا اسلايد آنتي ژن شيزونت
آنتي ژن مورد استفاده براي schizont IFA test ازتيره سلولي شيزونت ليمفوبلاستوئيد Lymphoblastoid گرفته ميشود. كشتهاي سلولي را كه داراي رقت 200 ميلي ليتر شيزونت در يك ليتر شيزونت هاي آلوده ( به T. parva ويا T. annulata بوده و حاوي ده ميليون سلول در هر ميلي ليتر و حداقل 90% سلولها آلوده ميباشند ) باشد را سانتريفيوژ كرده ( بمدت 20 دقيقه در سرعت 200 دور در دقيقه در دماي 4 درجه ) و مايع روئي را دور ريخته و سلولهاي ته نشين شده را با 100 ميلي ليتر بافر ( Phosphate buffered saline) PBS در دماي 4 درجه و pH 7.2 تا 7.4 مخلوط و دوباره سانتريفيوژ ميكنيم. اين روش شستشو را سه بار تكرار كرده و در آخرين با رسلولهاي ته نشين شده را با 100 ميلي ليتر PBS مخلوط كرده تا غلظت نهائي حدودCELL/ML7 10 درآيد.
گسترش نازك از محلول سلولي را روي اسلايد حفره دار ( از جنس تفلن )تهيه كرده ويا روي لام معمولي را با استفاده از لاك ناخن تقسيم كنيم . هر گسترش بايد داراي 50 تا 80 سلول سالم در هر ديد ميكروسكوپي Field باشد (وقتيكه با بزرگنمايي 40 با روغن Immersionبررسي شود) .بوسيله پي پت 100μlآنتي ژنهارا با مكش يكدفعه روي لام ريخته كه پس از توزيع محلول شيزنت يا پيروپلاسم يك لايه Monolayer در هر كدام باقي مي ماند. اينكار را براي هر حفره انجام داده تا مايع تمام شود. بااين روش تقريبا“مي توان 600لام با كيفيت خوب كه حاوي 6 هزار سلول در هر نقطه آنتي ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشك كرده ودراستن بمدت ده دقيقه ثابت كرده (Fixation) وبطور جداگانه دردستمال كاغذي پيچيده و سپس در كاغذ آلومينيم (فويل آلومينيم ) وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردماي20- درجه سانتيگراديا 70 - درجه سانتيگراد نگه مي داريم . دردماي –20 درجه سانتيگراد بمدت يكسال قابل استفاده هستند ودردرماي –70 درجه سانتيگراد بمدت طولاني تر (دردماي يخچال 4 درجه سانتيگراد بمدت چهارماه قابل نگهداري هستند).
ب- محلول آنتي ژن شيزونت
ابتدا 500 ميلي ليتر از محلول T.annalataيا T. parva سلولهاي آلوده با غلظت 10 6cell/ml سلول سانترفيوژكرده (در 150 g دور دردقيقه براي ده دقيقه در دماي 4 درجه ) وسلولهاي ته نشين شده در100سي سيPBS سرد دوبار شستشو مي دهيم.
قابليت زنده بودن سلولها را بوسيله اوزين Eosin يا Trypan blueبررسي ميشود (كه بايد بيش از %90باشد )محلول سلولها بايد درمحلول سرم فيريولوژي سرد رقيق شود تا غلظت 7 10سلول (/mlCell) بدست آيد دراين حجم ، دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوي 80% استن و 0.1 % فرمالين در PBS قطره قطره اضافه كرده (در درماي –20 درجه )تا درمدت 24 ساعت به تثبيت رسد.
سلولهاي ثابت شده را سه بار شستشو داده (در سرم فيولوژي سرد شده دردماي 4 درجه ) ودر 200 دور دردقيقه بمدت 20 دقيقه سانترفيوژ ميكنيم. بعد از آخرين شتشو سلولهاي ته نشين شده را در سرم فيولوژي رقيق كرده تا غلظت 107/ml بدست آيد . بميزان 5/0 سي سي سلولهاي ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسيم مي كنيم .
تهيه اسلايد حاوي آنتي ژن پيروپلاسم:
مرحله پيرپلاسمي گونه هاي تيلريا را نمي توان دركشت سلول نگهداري يا تهيه نمايند. زيرا آنتي ژن پيروپلاسمي بايد از حيوانات زنده آلوده تهيه شود و عفونتهاي تجربي بوسيله تزريق زير پوستي با اسپروزئيت يا كنه هاي آلوده باT.parvaT.taurotragi ,T.annulata , صورت ميگيرد. آلودگي گروه انگلي T.sergenti/ T.buffeli/ T.orientalis ,T.mutans or T.velifera بوسيله تزريق داخل رگي خون حيوان ناقل به گاو يا گوساله طحال برداشته و يا تماس با كنه آلوده ايجاد مي شود. وقتيكه آلودگي پيروپلاسمي بيش از 5%باشد، صد ميلي ليتر خون آلوده آغشته با مواد ضد انعقاد را بخوبي با PBS مخلوط مي كنيم . اين مخلوط را سانترفيوژ كرده (با500دور در دقيقه براي ده دقيقه) و بعدپلاسما و Buffy Coat را جدا كرده و RBCهاي باقي مانده را بادوليتر PBSرقيق مي كنيم. سپس دوباره سانترفيوژ كرده وهمينطور Buffy coat را جدا ميكنيم . اين عمل رابراي چهار بار تكرار مي كنيم و بعد از پنجمين ششتشو، مقداري از RBC هاي جمع شده Packed RBC را با PBS مخلوط كرده واز آن 5μl روي هر اسلايد مي گذاريم. نقاط خشك شده را با متانول تثبيت كرده وبا رنگ آميزي گيمسا رنگ ميكنيم ونهايتا زيرميكروسكوپ نوري بررسي مي كنيم . تقريبا ده هزار اسلايد آنتي ژني (صد هزار نقاط آنتي ژن ) ا ز100سي سي خون آلوده تهيه مي شود. اسميرهاي آنتي ژني را در دماي اتاق خشك كرده وبعد در دماي 4 سانتيگراد درجه در استن بمدت ده دقيقه فيكس ميكنيم. اسميرهاي فيكس شده شبيه اسلايدهاي آنتي ژني شيزونت نگهداري ميشوند.
محلول يا سوسپانسيون حاوي پيروپلاسم :
يك روش تهيه آنتي ژن براي T.parva قبلا“شرح داده شد دراين روش صد ميلي ليتر از خون حيوانيكه شديدا“ در مرحله آلودگي پيروپلاسمي باشد گرفته و مانند آنچه شرح داده شد،گلبولهاي قرمز تجمع كرده را به PBS اضافه كرده تا محلول 5% بدست آيد.- در مراحل فوق بايد آنتي ژن را استانداردكرد-
تهيه lysateBovine Lymphocyte : اين ماده طبق روش Godderis et al.براي بررسي محلول آنتي ژن T. parva بكار مي رود . ابتدا يك گوساله سه ماهه كه طحال آنرا برداشته اند را درنظر گرفته و واز طريق تماس با كنه و يا پشه تسه تسهtse Tseآلوده مي كنيم وروزانه بمدت چهارهفته با رنگ آميزي گيمسا بررسي ميكنيم . نهايتا بعد از مرگ يا كشتن حيوان از تيموس و غددلنفاوي نمونه برداري مي كنيم .
بافتها را به قطعات كوچكتر تقسيم كرده ودر PBS سرد ( در دماي 4 درجه) بهمراه %45 /.0 مواد ضد انعقاد نگهداري ميكنيم . سلولها را از بافت بوسيله پارچه MUSLIN جدا كرده و سه بارشتشو با مخلوط PBS-EDTAميدهيم و در دور 200 بمدت 20 دقيقه در دماي 4 درجه سانتريفيوژ ميكنيم . لينفوسيتهاي شسته شده را با PBS كه عاري از EDTA باشد، مخلوط مي كنيم تا غلظت نهائي CELL/ML 107*5 بدست آيد .
روش كار براي تشخيص آنتي بادي فلورسانس:
اسلايد شيزونت يا پيروپلاسم را از دماي انجماد، 20- درجه سانتيگراد در آورده و بمدت 30 دقيقه در دماي يخچال، 4 درجه گذاشته و سپس 30 دقيقه ديگر در دماي اتاق ميگذاريم.
بوسيله پي پت پاستور 100/μl آنتي ژن را روي هر لام ريخته ودردماي اتاق 37 درجه خشك مي كنيم . ميتوان براي تلعلع بهتر وديد بهتر از Evansblue نيزبهمراه رنگ فلورسانس استفاده كرد و بعد در گلسيرول 50% در pH 8 ميگذاريم تا رنگ Fluorescein isothiocyanate بمدت طولاني تر و عميق تر اثر گذارد . اسلايدهاي تهيه شده تا 72 ساعت در دماي 4 درجه د رتاريكي قابل نگهداري و استفاده ميباشند. بدنبال عفونت با اسپروزئيت ها آنتي بادي هاي توليد شده بر عليه T.parva و T.annulate ابتدا" بين روزهاي دهم تا 14 برعليه شيزونت ودر بين روزهاي 15-21 بر عليه پيروپلاسم قابل تشخيص مي باشند. پادتنها بعد از بهبودي ناپديد مي شوند ووابسته به فاكتورهاي متفاوتي از جمله وضعيت ناقل، فاصله مابين درمان، درمعرض قرار گرفتن و تماس دوباره با كنه آلوده تغيير مي كنند. معمولا“ 4 تا 6 ماه بعد از آلودگي آنتي بادي پائين مي آيد (در صورتيكه تماس دوباره پيش نيايد).
بدنبال آلودگي با T.mutans آنتي بادي در روزهاي دهم تا 15 قابل اندازه گيري بوده و بعد از 12-24 ماه پائين ميآيد.
ب: نيازمنديهاي لازم جهت تهيه واكسنها و تشخيصهاي بيولوژيك
1- واكسنهاي كشت سلولي براي تيلريا آنولاتا:
از اوائل قرن بيستم كه عامل بيماري تيلريا شناخته شد مايهكوبي برعليه بيماري تيلريا مورد نظر قرار گرفت . گرچه يك واكسن زنده با قدرت ايمني زائي شناخته شده اخيرا“به توليد رسيده است چيزي كه بيشتر تا حالا مورد استفاده قرار گرفته كشت سلولي شيزونت تغيرحدت يافته است . براي مقابله با تيلريا آنولاتا نحوه توليد و تستهاي ارزشيابي قبلا“ تشريع شده است . اين نوع واكسن بصورت گستردهاي در كشورهاي ايران ،تركيه ،هندوستان وروسيه و چين مورد استفاده قرار گرفته است.
درسته؟
